Cyanine 系列染料琥珀酰亚胺酯

Cyanine 系列染料琥珀酰亚胺酯

产品简介

Cyanine系列，即花青素系列染料是最常用的荧光染料之一。它荧光很亮，对 pH   不敏 感，另外它的荧光母核依赖不同长度的亚甲基桥链实现各种波长的荧光激发和发射，从而可 以实现从可见光到近红外光区的荧光覆盖，供研究者灵活选择，比如Cy3 为黄红色荧光染料， 在普通荧光显微镜下肉眼可见，Cy7.5 可用于小动物的近红外体内成像。

Cyanine 系列染料包括普通Cy 染料和水溶性Cy 染料，它们具有相同的荧光性质。普通 Cy 染料水溶性较差，但价格便宜，适用于高分子材料、纳米端、小分子等各种标记对象；水 溶性Cy 染料，即sulfo-Cy,   是磺酸化的Cy 染料，每个染料分子至少含2个磺酸离子，水溶 性很强，特别适用于标记蛋白质等对疏水结构敏感的标记对象，可用于替代 Alexa Fluor、 DyLight 等染料。

琥珀酰亚胺酯 (succinimidyl esters),也常叫做se 或 NHS 活化酯，是最常见的活化官能 团，可和氨基反应，生成稳定，无毒的酰胺键。Cy 染料琥珀酰亚胺酯以干燥固体的形式实现 稳定储存，可随时与溶剂(有机溶剂或者水)复溶后对氨基官能团进行染料标记。标记反应 可以在有机溶剂中进行，也可以在缓冲盐中或者缓冲盐和有机溶剂的混合溶剂中进行，可根 据染料的水溶性和标记对象的稳定性决定。NHS 活化酯主要和伯氨基反应，比如多肽N 端和 蛋白质中的赖氨酸侧链氨基，与其它氨基的反应活性都比较小，比如和苯氨基、苯酚、醇羟 基都不反应。另外，NHS活化酯优于其它氨基标记基团，比如异硫氰酸酯(isothiocyanate),

NHS反应活性更强，选择性高，并且生成的酰胺键和肽键结构一样，很稳定，比异硫氰酸酯 生成的异硫氰酸酰胺(如 FITC标记)要牢靠。

特别注意

琥珀酰亚胺活化酯对湿气敏感，在含水条件下会缓慢水解为羧酸，失去对氨基的标记能力。 活化酯一般在-20℃干燥保存，使用前请预先从冰箱中取出放置干燥器中，平衡到常温后再打开瓶盖。NHS活化酯用无水溶剂(如无水 DMSO、 无水 DMF) 溶解后也无法长时间保存，应尽快使用(尽量24h 内),因为溶剂中残留的微量水分子也会让活化酯水解。活化酯更不能在水溶剂中保存。

常见添加剂，比如叠氮化钠(≤3mM or 0.02%) 或 thimerosal(≤0.02mM or 0.01%),对 蛋白标记反应没有影响，但是20-50%的甘油会降低标记反应效率。此外，Tris、甘氨酸等带伯氨基的缓冲盐会让NHS活化酯试剂失活，严禁在此类溶液中进行标记反应。

标记步骤

下面是以标记蛋白质为例，讲述 NHS 活化酯染料的常规标记方法。对于特殊标记条件和要求，可以根据实验情况个体优化。

标记准备工作：

反应体系溶剂标记 一般在混合溶剂(水溶液+少量有机溶剂)中进行。sulfo-Cy由于水溶性强，不需要有机溶剂助溶，可在水溶液中标记，避免有机溶剂对生物样品的刺激和伤害。NHS活化酯在微碱性条件下反应的活性比较高，综合考虑反应速度和活化酯水解速度，一般选择在pH 8.5左右的pH值范围进行标记反应。最优化的反应缓冲盐是50 mM的硼酸钠溶液(50mM   Na₃BO₃,pH8.5)。除此以外，磷酸钠缓冲盐PBS(0.1MN₃PO,0.15MNaCl, pH7.2-7.5),NaHCO3溶液(0.1M NaHCO₃,pH 8.3-9.0) 也可以用于标记反应。带有氨基的缓冲液 (甘氨酸)会自身和 NHS活化酯反应，所以不可使用，如果蛋白样品中含有这些缓冲盐，必须通过透析或者除盐柱将这些氨基盐除掉后才可以用于标记反应。如果标记对象是高分子、小核酸等耐有机溶剂材料，标记反应也可以在纯有机溶剂体系(比如甲醇、乙腈或者氯仿等)中进行，纯有机溶剂体系可以降低 NHS 活化酯的水解速度，从而在较低的染料/对象比例下实现高效标记(需加入有机碱比如三乙胺促进反应进行)。

染料母液配制 Cy系列NHS活化酯染料对湿气很敏感。为了避免空气中水汽在低温样品表 面凝结失活样品，低温冰箱中取出的活化酯在室内放置到室温后再打开瓶盖进行母液配制。染料一般用无水DMF或无水DMSO溶解，推荐母液浓度为10mg/ml。母液也可以配制为 1mg/ml或者其它浓度，以便更准确的移液操作。如果对一些特别敏感的蛋白质样品，推荐使用sulfo-Cy系列染料，这样可以将染料直接加入反应水溶液体系中，回避使用有机溶剂。

染料标记比例 为实现每个蛋白标记大于1个染料分子的目标，在混合溶剂反应体系中， 染料/标记对象的摩尔比例一般是5-10/1;纯有机溶剂体系中可以降低到约3/1。为提高标记效率，应尽可能在高浓度、小反应体积条件中进行，比如标记蛋白质，蛋白质的浓度最好在 1-10mg/ml 。上述推荐比例仅仅是多荧提供的参考比例，具体比例需根据个人预实验摸索后 决定，因为蛋白标记的效率与蛋白结构、反应体积、反应溶剂、实验温度、反应时间和纯化方式都有关系。标记后的蛋白以每个蛋白分子上偶联1-4个染料为最佳(视蛋白稳定性和大小而定),标记过多会影响蛋白的活性和稳定性，严重时会变性沉淀。

标记反应步骤：

将需要标记的蛋白质溶液转移到反应小管中。

根据染料标记摩尔比例，加适量的染料母液入反应小管中，用移液器上下轻轻打动混匀。常温下静置或轻微混动，反应1-5小时，反应时间延长有助于提高标记效率，最多可以标记过夜。对于蛋白质等敏感材料，反应中有机溶剂体积比控制在5%左右，如果有大量染料析出(疏水性Cy染料),可适量增加体积到10%或更高，如果是磺化染料，也可以在水中直接标记。

利用透析，或者除盐柱，除去未标记的游离染料分子。也可以采用硫酸铵沉淀法或乙醇 沉淀法等方法纯化样品(硫酸铵沉淀法沉淀蛋白适用于蛋白浓度很高的情况，最好10 mg/ml以上)。透析时，为了快速的透出染料分子，请采用至少截留分子量>10KDa的透析袋，最好每4个小时更换透析液，重复更换3次。凝胶过滤法，比如除盐柱，也可以纯化蛋白标记，虽然这个方法比较快捷，但是效率可能会不如透析法。

在避光条件下，将纯化后的蛋白样品溶液可短期储存在4℃冰箱。或者加入冷冻保护剂 (比如甘油)、分装后放入-20℃冰箱，长期保存。